農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞 克隆與表達(dá)分析

EHA105(pSoup) Electrocompetent Cell

農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

EHA105菌株；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物轉(zhuǎn)基因研究；

產(chǎn)品訂購(gòu)：更大包裝或產(chǎn)品技術(shù)問(wèn)題，

產(chǎn)品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來(lái)，染色體背景為C58，核基因含篩選標(biāo)簽—利fu平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能雖被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。在EHA105菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup，即得到：EHA105 (pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素（tetR）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105(pSoup)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，特別適合大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。基因型為C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine(pSoup-tetR)，經(jīng)pGs2質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105cfu/μg DNA。

產(chǎn)品組分：

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，1年有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融和放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2） 整個(gè)轉(zhuǎn)化操作，嚴(yán)格根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件要求進(jìn)行。

3） 加入質(zhì)粒的體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率急劇下降。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4） 為確保zui高轉(zhuǎn)化效率，整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)盡量輕柔，并保持低溫。

5） 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終涂板用量。

6） 平板上克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

7） 培養(yǎng)基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈mei素或慶大mei素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈mei素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈mei素或慶大mei素，因Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（基本可以忽略）

8） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 將0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發(fā)干凈，立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2) 取-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min，待其融化。

3) 往50μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于6μl）質(zhì)粒DNA，用手bo打管底使其混勻，立即插入冰中。用槍輕輕吹打混勻感受態(tài)細(xì)胞-質(zhì)粒之后快速轉(zhuǎn)移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用【注意：由于感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，di一次使用zuihao做預(yù)試驗(yàn)確定zuijia的質(zhì)粒用量】。

4) 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)參考Bio-rad，具體使用請(qǐng)參考電轉(zhuǎn)儀推薦步驟來(lái)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5) 加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3h。

6) 6,000rpm離心1min，留取約 100ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，用無(wú)菌玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養(yǎng)2-3天。【注意：當(dāng)平板只含轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；當(dāng)平板中加入雙元載體抗生素的同時(shí)，再加入10μg/ml利fu平時(shí)，需28℃培養(yǎng)48-60h；當(dāng)平板中加入雙元載體抗生素的同時(shí)，再加入20μg/ml利fu平時(shí)，需28℃培養(yǎng)60-72h;不建議使用超過(guò)20μg/ml的利fu平用于平板或液體培養(yǎng)。

7) 目的克隆的液體培養(yǎng)：

j小量搖菌：往15ml的圓底透氣試管中加入1ml含對(duì)應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，從新鮮培養(yǎng)的平板上挑1-2個(gè)單菌落接種，30℃，200rpm搖菌24-48h。

k大量搖菌：100ml透氣三角瓶?jī)?nèi)加入少于20ml含對(duì)應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，取小搖菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm搖菌24-48h。

【注意】：對(duì)于農(nóng)桿菌（好氧菌）來(lái)說(shuō)，不論是固體平板還是液體搖菌均需要大量氧氣。液體搖菌成功的關(guān)鍵就是要保證培養(yǎng)基中含足夠的溶解氧，可通過(guò)以下方法來(lái)控制：j用透氣試管或三角瓶；k確保營(yíng)養(yǎng)液有大的橫截面和小的厚度；l抗生素盡量少加或不加，必須添加的抗生素盡量使用低濃度。

相關(guān)產(chǎn)品【感受態(tài)細(xì)胞系列】

附表1固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2固體和液體YEB培養(yǎng)基配方

附表3常見(jiàn)農(nóng)桿菌對(duì)抗生素敏感性總表

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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