大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)分析

BL21-AI Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

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產(chǎn)品標(biāo)簽：

BL21 Star (DE3) pLysS；Rosetta (DE3)；BL21 (DE3)；表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；pET表達(dá)載體；IPTG誘導(dǎo)；非毒性蛋白表達(dá)；

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【好消息】：見(jiàn)我司整理的BL21系列表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞常見(jiàn)問(wèn)題。 

產(chǎn)品組分：

菌株描述

BL21-AI菌株來(lái)源于BL21菌株，是一種大腸桿菌B/r菌株（E. Coli B/r）。含有一個(gè)染色體整合的編碼T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的基因到araBAD操縱子的araB位點(diǎn)，通過(guò)操控araBAD啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)T7 RNA聚合酶的表達(dá)。此菌株已經(jīng)敲除araB基因。tetA基因賦予四環(huán)素抗性，允許用四環(huán)素來(lái)驗(yàn)證菌株。

由于T7 RNAP基因位于araBAD操縱子的araB位點(diǎn)，因此，可通過(guò)糖類（L-阿拉伯糖和葡萄糖）來(lái)調(diào)節(jié)T7 RNA聚合酶的表達(dá)。在培養(yǎng)基內(nèi)加入L-阿拉伯糖，能夠誘導(dǎo)araBAD啟動(dòng)子下游T7 RNA聚合酶表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白表達(dá)；而在培養(yǎng)基加入葡萄糖，能夠抑制araBAD啟動(dòng)子下游T7 RNA聚合酶表達(dá)，進(jìn)而抑制目的蛋白表達(dá)。BL21-AI菌株適用于任何以T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，進(jìn)行高水平的重組蛋白表達(dá)。由于T7 RNA聚合酶的表達(dá)水平能被高度調(diào)控，該菌株特別適用于表達(dá)對(duì)其他BL21菌株有毒或抑制生長(zhǎng)的蛋白。

BL21-AI菌株缺乏lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT的基因，這兩種酶的缺失能夠降低外源重組蛋白在菌體內(nèi)的降解，從而增加了蛋白表達(dá)量。最終，BL21-AI菌株表達(dá)所得的重組蛋白產(chǎn)量與其他BL21菌株相近。

BL21-AI菌株基因型：F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA

需求條件

建議在以下幾個(gè)情況下選擇BL21-AI菌株來(lái)表達(dá)您的目的基因：

a）   正在使用T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體（高拷貝或低拷貝皆可）

b）   當(dāng)使用其他BL21菌株發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象（比如毒性）

c）   正要表達(dá)一種已知的毒性蛋白

產(chǎn)品描述

本品是大腸桿菌BL21-AI菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱激轉(zhuǎn)化。特別適合任何以T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體系統(tǒng)，且要求嚴(yán)格調(diào)控和大量表達(dá)毒性蛋白的應(yīng)用。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108 cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個(gè)月有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）   感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存，不可反復(fù)凍融且放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)減低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2）   最好在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞。

3）   進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，需在相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件下進(jìn)行。

4）   為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

5）   產(chǎn)品包裝內(nèi)含質(zhì)粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供對(duì)照實(shí)驗(yàn)用。

6）   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

1）  從-80℃冰箱取出取感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌塊融化，加入目的DNA，用手輕彈管底輕輕混勻，冰浴靜置25min。

2）   42℃熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3min。此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

3）   向每個(gè)離心管中加700 μl無(wú)菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，200 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

4）   低速離心收菌（比如4000rpm，2min），留取100μl左右上清，用槍輕輕吹打重懸菌塊，之后加到含相應(yīng)抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-16h。

【注意】：

a）涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可不用離心，直接取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，則通過(guò)離心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。

b）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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