科普一下鈣離子熒光探針系列的三種使用方法

　　1、貼壁細胞

　　A. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用細胞培養(yǎng)級PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)過夜，使約為50%-80%滿。

　　B. 刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5ml固定液，固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

　　C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數(shù)次。

　　D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動晃動數(shù)次。

　　E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。

　　F. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液，切勿弄反。

　　G. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右，詳細圖譜請參考下圖。

　　2、懸浮細胞

　　A. 離心收集細胞樣品于1.5ml離心管內(nèi)，加入0.5ml固定液，緩緩懸起細胞，固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

　　B. 離心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。洗滌期間手動晃動。

　　C. 后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細胞分布均勻。

　　D. 稍晾干，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。

　　E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。

　　F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。

　　G. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

　　H. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左.

　　3、組織切片

　　A. 對于任何常見切片，處理至常規(guī)可以進行免疫染色時，或完成常規(guī)的免疫染色后，即可進行后續(xù)的Hoechst染色。B. PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數(shù)次。可在六孔板中操作。

　　C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動晃動。

　　D. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。

　　E. 將切片置于載玻片上，滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

　　F. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右，

　　Hoechst 33258的吸收光譜和發(fā)射光譜，左側(cè)峰為吸收光譜，右側(cè)峰為發(fā)射光譜。